脂质纳米颗粒（LNPs）是当前mRNA疗法领域的主流递送载体，其递送效能与颗粒内部的脂质结构及相态排布密切相关，直接决定了载体的稳定性、包封效率以及mRNA释放效率。动态光散射（DLS）、zeta电位测量等常规表征技术虽能提供粒径和表面电荷等信息，却无法揭示脂质与mRNA在纳米颗粒内部的具体排列方式。而像冷冻电镜（cryo-EM）、核磁共振（NMR）这类高分辨率表征方法虽可提供上述信息，但这类技术通常通量低，并不适用于需要快速筛选大量配方条件的研发初期阶段。
小角X射线散射技术（SAXS）可有效弥补这一缺口，它可以提供脂质纳米颗粒的结构、层状特征与内部排布提供了详细见解[1-6]。FDA针对脂质体药物制剂的指导原则中，已将类似的结构参数列为关键质量属性[7]。SAXS技术还能直接解析mRNA的封装状态[4,6,8,9]、脂质双层结构[10]、物相鉴定[1,2,8,11-12]，以及在不同pH[2,11,12]、温度[2]和脂质组成[1,2,5,10]条件下的结构稳定性。若结合广角X射线散射技术（WAXS），还可进一步识别制剂中的晶相结构[13]，从而为配方优化与质量控制评估提供有力支撑。
近期，Sanofi的研究人员利用实验室SAXS/WAXS技术，成功表征了PEG化mRNA-LNPs，并揭示了其结构特征图谱与递送效率之间的内在关联[1]。
为探究PEG化对mRNA-脂质纳米颗粒内部结构的影响，他们选取了三类配方进行比较分析。其中两种作为参照体系：一种含DMG–PEG2000（Std1），另一种含DMG–PEG5000（Std2）。前者是LNP研发中应用广泛的标准配方，而后者则是通过数十种PEG化脂质筛选后确定的配方。第三种为优化配方（OPT），其同样采用 DMG–PEG5000，但通过实验设计（DoE）方法进行了进一步的配方改良。该策略能够系统性地探究脂质组分的影响，从而筛选出最利于 mRNA高效递送的结构特征。通过对比这三种代表性体系，研究人员可以直接获得PEG链长与组分优化如何影响层状与六方相结构的动态平衡、结构有序度，并最终影响与递送效率密切相关的各项性能[1]。
SAXS揭示mRNA-LNPs的层状与六方相结构
通过对三种配方的SAXS图谱分析，其中有两种显著的结构特征信号：位于q ≈ 0.13 Å⁻¹处的布拉格峰对应于反六方相结构，而q ≈ 0.16 Å⁻¹处的峰则对应于多层层状相结构（图1）。冷冻电镜结果进一步证实了这两种物相在脂质体内的共存，凸显了SAXS技术在溶液物相鉴定中的可靠性。在优化配方（OPT）中，层状相的重复间距约为4.0nm，六方相间距约为4.9nm，该数据与冷冻透射电镜的测量结果高度一致。
Figure 1. 在10%海藻糖溶液中，OPT mRNA-LNP配方与两种标准配方Std1和Std2的SAXS图谱对比。
来源: Nanoscale, 2025 DOI: 10.1039/D5NR00433K
除物相鉴定外，SAXS技术还成功捕捉到纳米结构有序度的差异。与两种参照配方（Std1、Std2）相比， OPT的反六方相峰更尖锐、强度更高，半峰宽更窄（表1）。这表明存在更大且有序度更高的六方相结构。与此同时，OPT配方的层状相峰相对较弱，如较小的Area2/1所示，反映出结构明显向具有膜融合活性的六方相转变。该相态因能有效促进膜融合和内体逃逸而广为人知，二者均是实现mRNA高效释放的关键步骤。
Table 1. 在10%海藻糖溶液中，OPT、Std2及Std1配方的SAXS峰特征对比。来源: Nanoscale, 2025 DOI: 10.1039/D5NR00433K
SAXS揭示pH驱动mRNA释放的结构转变机制
为探究pH值这一模拟内体环境的关键参数对结构的影响，研究人员采用SAXS技术监测三种配方在不同pH条件下的结构转变过程。
在接近生理pH（7.5）条件下，优化配方（OPT）的SAXS图谱同时呈现出显著的层状相与六方相结构特征，而两种参照配方（Std1、Std2）仅呈现较弱的多层状相信号（图2）。
随着pH值降低，Std1与Std2配方发生了显著的结构重组——其层状相与六方相衍射峰逐渐变得更为尖锐，体现出结构从相对无序向有序的转变。与此形成鲜明对比的是，OPT配方即使在pH低至4.5的条件下，依然保持着最强的反六方相衍射峰信号（图2-3）。这一结果说明OPT体系在生理条件下已预先形成了更稳定、更有序的融合活性结构，从而为其实现高效的内体逃逸与mRNA释放提供了结构基础。
Figure. 2. OPT、Std2与Std1配方在不同pH值柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的SAXS图谱对比。来源: Nanoscale, 2025 DOI: 10.1039/D5NR00433K
Figure 3. OPT mRNA-LNP配方在不同pH值柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的SAXS图谱变化。来源: Nanoscale, 2025 DOI: 10.1039/D5NR00433K
此外，SAXS数据还显示，在酸性pH条件下，布拉格峰位置向更低q值方向移动，对应的晶面间距随之增大（图3）。这种结构膨胀意味着纳米颗粒吸入了水分，而该结构调整也进一步体现出其对内体环境的响应特性。
SAXS/WAXS揭示从纳米结构与递送的核心结论
研究结果充分证明，实验室级SAXS/WAXS技术能够有效解析LNPs的内部组织结构，可定量获取脂质层重复间距（晶格间距）与结构规整度（纳米结构有序性）等关键参数。这些发现与冷冻电镜结果高度一致，同时兼具高通量、溶液原位表征的技术优势。
重要的是，SAXS/WAXS技术不仅能够识别出明确的结构特征图谱，还可追踪这些结构随pH变化的动态转变过程，这一特性对于理解内体逃逸过程至关重要。优化后的配方呈现出更尖锐、有序度更高的六方相结构，且结构明显偏向于具有膜融合活性的物相，这与实验中观察到的mRNA释放效率提升现象相符。
通过直接建立纳米结构与递送性能之间的联系，SAXS/WAXS技术能够支持多条件下配方的快速筛选、构效关系研究，以及工业化生产流程中的质量评估。总之，SAXS/WAXS已成为设计、优化及质控下一代mRNA-LNP疗法的可靠高通量工具。
The research was originally published in the following article: [1] Liu, L., Kim, J.H., Li, Z., Sun, M., Northen, T., Tang, J.,. Mcintosh, E., Karve, S., DeRosa, F. PEGylated lipid screening, composition optimization, and structure-activity relationship determination for lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery. Nanoscale, 2025 17, DOI: 10.1039/d5nr00433k.
参考文献
[1] Liu, L., Kim, J.H., Li, Z., Sun, M., Northen, T., Tang, J., Mcintosh, E., Karve, S., DeRosa, F. PEGylated lipid screening, composition optimization, and structure-activity relationship determination for lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery. Nanoscale, 2025, 17, 11329–11344, DOI: 10.1039/d5nr00433k.
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